腺相關(guān)病毒系統(tǒng)載體及應(yīng)用方法pAAV-MCS pAAV-RC pAAV-Helper. BioVector NTCC質(zhì)粒載體菌種細(xì)胞基因保藏中心
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腺相關(guān)病毒(AAV)簡(jiǎn)介-BioVector NTCC質(zhì)粒載體菌種細(xì)胞基因保藏中心
腺病毒相關(guān)病毒(adenovirusassociatedvirus，AAV)是一類(lèi)單鏈線狀DNA缺陷型病毒。其基因組DNA小于5kb，無(wú)包膜，外形為裸露的20面體顆粒。AAV不能獨(dú)立復(fù)制，只有在輔助病毒（如腺病毒、單純皰疹病毒、痘苗病毒）存在時(shí)，才能進(jìn)行復(fù)制和溶細(xì)胞性感染，否則只能建立溶源性潛伏感染。
簡(jiǎn)介：
重組腺相關(guān)病毒載體是利用天然存在的腺相關(guān)病毒某些特性經(jīng)過(guò)基因工程改造后產(chǎn)生的一種可供人工轉(zhuǎn)基因的載體。腺相關(guān)病毒(adeno-associatedvirus，AAV)是簡(jiǎn)單的非致病性單鏈DNA病毒，需要輔助病毒參與生活周期，輔助病毒通常為腺病毒(Ad)或者單純皰疹病毒(HSV)。基因組兩端為末端反向重復(fù)序列(ITR)，中間基因組編碼兩個(gè)蛋白：Cap和Rep。ITRs對(duì)于病毒的復(fù)制和包裝具有決定性作用。Cap蛋白為病毒衣殼蛋白，Rep蛋白參與病毒的復(fù)制和整合。AAV能感染多種細(xì)胞。Rep蛋白存在時(shí)，病毒基因組很容易整合到人類(lèi)第19號(hào)染色體的特異位點(diǎn)：AAVS1位點(diǎn)。這是已知的唯一能夠定點(diǎn)整合的哺乳動(dòng)物DNA病毒。
重組腺相關(guān)病毒載體(rAAV)源于非致病的野生型腺相關(guān)病毒，由于其安全性好、宿主細(xì)胞范圍廣(分裂和非分裂細(xì)胞)、免疫源性低，在體內(nèi)表達(dá)外源基因時(shí)間長(zhǎng)等特點(diǎn)，被視為最有前途的基因轉(zhuǎn)移載體之一，在世界范圍內(nèi)的基因治療和疫苗研究中得到廣泛應(yīng)用。
特點(diǎn)：
優(yōu)點(diǎn)：以潛伏感染為主；AAV可以高效定點(diǎn)整合至人染色體中：可以避免隨機(jī)整合可能帶來(lái)的抑癌基因失活和原癌基因激活的潛在危險(xiǎn)性，而且外源基因可以持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)。
缺點(diǎn)：AAV載體容量小，目前最多只能容納4.5kb外源DNA片段；感染效率比逆轉(zhuǎn)錄病毒載體低。在40%-80%的成人中存在過(guò)感染，可能會(huì)引起免疫排斥。
重組腺病毒相關(guān)載體構(gòu)建：
AAV選擇的條件：
1.治療基因的長(zhǎng)度不能過(guò)大。AAV的總?cè)萘?.5kb，還要包括AAV自身的ITR，啟動(dòng)區(qū)和RNA加尾信號(hào)；
2.基因需要持續(xù)表達(dá)，蛋白可以是分泌型，也可以是非分泌型；
3.長(zhǎng)期表達(dá)目的基因，沒(méi)毒副作用；
4.不需要目的基因立刻表達(dá)；
5.不需要基因高水平表達(dá)；
6.AAV載體對(duì)靶細(xì)胞具有較高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。
AAV病毒的感染細(xì)胞
AAV載體對(duì)于骨骼肌、視網(wǎng)膜、肝細(xì)胞、心臟平滑肌細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、胰島B細(xì)胞、關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞等具有良好的感染效果，而對(duì)于淋巴細(xì)胞、造血干細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等感染效果較差。
腺病毒相關(guān)載體應(yīng)用：
經(jīng)過(guò)十幾年的研究，重組腺相關(guān)病毒的生物學(xué)特性已被深入了解，尤其是其在各種細(xì)胞、組織和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用效果方面已經(jīng)積累了許多資料。在醫(yī)學(xué)研究中，rAAV被用于多種疾病的基因治療的研究(包括體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn))；同時(shí)作為一種有特點(diǎn)的基因轉(zhuǎn)移載體，還廣泛用于基因功能研究、構(gòu)建疾病模型、制備基因敲除鼠等方面。目前已發(fā)現(xiàn)的AAV至少有十幾種血清型，它們主要區(qū)別在衣殼蛋白Cap的不同，因此導(dǎo)致各種血清型AAV對(duì)不同的組織和細(xì)胞的不同感染效率。目前普遍認(rèn)為，rAAV是最為優(yōu)秀可用于基因治療的重組病毒載體。
特點(diǎn)
優(yōu)點(diǎn)
缺點(diǎn)
腺病毒相關(guān)載體構(gòu)建
AAV選擇的條件
AAV病毒的感染細(xì)胞
病毒的加樣量
病毒要求
病毒級(jí)別
腺病毒相關(guān)載體應(yīng)用
腺相關(guān)病毒屬微小病毒( parvovirus)家族的成員，為無(wú)包膜的單鏈線狀DNA病毒。AAV的基因組約4700bp。基因組5‘、3’端各有一個(gè)145nt的反向末端重復(fù)序列（ITR）。在兩個(gè)ITR之間存在兩個(gè)開(kāi)放閱讀框，其中Rep基因參與病毒的復(fù)制和整合，Cap基因編碼病毒衣殼蛋白。
圖1 AAV病毒基因組
腺相關(guān)病毒具有安全性高、免疫原性低、能介導(dǎo)基因在動(dòng)物體內(nèi)長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)，因而被認(rèn)為是最有潛力成為基因治療工具的載體而在國(guó)內(nèi)外研究中廣泛應(yīng)用。
應(yīng)用優(yōu)勢(shì)：動(dòng)物和臨床試驗(yàn)
AAV進(jìn)入細(xì)胞前，首先要通過(guò)衣殼蛋白與細(xì)胞表面的相應(yīng)受體結(jié)合，進(jìn)而附著于細(xì)胞表面，隨后通過(guò)衣殼蛋白與其它復(fù)合受體的相互作用來(lái)起始病毒顆粒的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)等生物學(xué)活動(dòng)。AAV不同血清型有不同的衣殼蛋白，進(jìn)而可與不同的細(xì)胞表面受體結(jié)合，體現(xiàn)出血清型對(duì)不同組織器官的不同親和性。在包裝腺相關(guān)病毒時(shí)有9種不同的AAV血清型可供客戶(hù)選擇，建議客戶(hù)針對(duì)不同組織器官選擇相應(yīng)血清型的AAV病毒，見(jiàn)下表。
AAV載體不同血清型
研究發(fā)現(xiàn)AAV 具有多種血清型，各種不同血清型的AAV 載體的主要區(qū)別是衣殼蛋白不同，因此對(duì)不同的組織和細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率存在差異。目前Biovector NTCC保藏中心在包裝腺相關(guān)病毒時(shí)有 12種不同的 AAV 血清型可供客戶(hù)選擇，建議客戶(hù)針對(duì)不同組織器官選擇相應(yīng)血清型的 AAV 病毒，見(jiàn)表 2。
表1. 12種不同血清型AAV對(duì)各組織器官細(xì)胞的親和性
血清型 | 組織親和性 |
AAV1 | 肌肉，心臟，骨骼肌（包括心肌），神經(jīng)組織 |
AAV2 | 中樞神經(jīng)，肌肉，肝臟，腦組織，眼， |
AAV3 | 肌肉，肝臟，肺，眼 |
AAV4 | 中樞神經(jīng)，肌肉，眼，腦 |
AAV5 | 肺，眼，中樞神經(jīng)，關(guān)節(jié)滑膜，胰腺 |
AAV6 | 肺，心臟 |
AAV7 | 肌肉，肝臟 |
AAV8 | 肝臟，眼，中樞神經(jīng)，肌肉 |
AAV9 | 心臟，肌肉，肺（肺泡），肝臟，中樞神經(jīng) |
DJ | 肝臟，視網(wǎng)膜，肺，腎臟 |
DJ/8 | 肝臟，眼，中樞神經(jīng)，肌肉 |
Rh10 | 肺, 心臟，肌肉，中樞神經(jīng)，肝臟 |
AAV生物學(xué)特性
表2 不同病毒的生物學(xué)特性比較
慢病毒 | 逆轉(zhuǎn)錄病毒 | 腺相關(guān)病毒 | 腺病毒 | |
包膜 | 有 | 有 | 無(wú) | 無(wú) |
顆粒直徑 | 90-100 nm | 90-100 nm | 20-30 nm | 60-90nm |
基因組 | dsRNA | dsRNA | ssDNA | dsDNA |
表達(dá)起始時(shí)間 | 48-72h | 48-72h | 72-96h | 24-48h |
表達(dá)持續(xù)時(shí)間 | > 2 months | > 2 months | > 6 months | ~1 month |
宿主基因組整合方式 | 隨機(jī)高頻整合 | 隨機(jī)高頻整合 | 定向低頻整合或非整合 | 非整合 |
常用質(zhì)粒：
腺相關(guān)病毒可用于基因的過(guò)表達(dá)（3kb以下）、shRNA（單條或者多條串聯(lián)）、miRNA（pre-miRNA或者pri-miRNA）、可誘導(dǎo)表達(dá)。腺相關(guān)病毒載體有CMV、mCMV、CAG、PGK、UbC、EF1a、GFAP等多種啟動(dòng)子可供選擇，常用載體如下表。
載體名稱(chēng) | 包裝容量 | 載體用途 |
pAAV-CMV-MCS | <3kb | 過(guò)表達(dá) |
pAAV-CMV-MCS-ZsGreen | <2.2kb | 過(guò)表達(dá) |
pAAV-CMV-MCS-IRES-ZsGreen | <1.7kb | 過(guò)表達(dá) |
pAAV-CMV-MCS-IRES-mCherry | <1.7kb | 過(guò)表達(dá) |
pAAV-CAG-MCS | <2.4kb | 過(guò)表達(dá) |
pAAV-CAG-IRES-ZsGreen | <1.2kb | 過(guò)表達(dá) |
pAAV-ZsGreen-ShRNA | N/A | ShRNA |
pAAV-tdTomato-ShRNA | N/A | ShRNA |
pAAV-CMV-ZsGreen-miRNA | N/A | miRNA |
pAAV-CMV-ZsGreen-MCS | N/A | 過(guò)表達(dá)/miRNA |
pAAV-MCS Stratagene 腺相關(guān)病毒系統(tǒng) pAAV-RC Stratagene 腺相關(guān)病毒系統(tǒng) pHelper Stratagene 腺相關(guān)病毒系統(tǒng) pAAV-LacZ Stratagene 腺相關(guān)病毒系統(tǒng) pAAV-IRES-hrGFP Stratagene 腺相關(guān)病毒系統(tǒng) pCMV-MCS Stratagene 腺相關(guān)病毒系統(tǒng) pAAV-MCS 過(guò)表達(dá)AAV載體 pAAV-EGFP GFP標(biāo)記，空白AAV質(zhì)粒 pAAV-ZsGreen GFP標(biāo)記，空白AAV質(zhì)粒 pAAV-tdTomato RFP標(biāo)記，空白AAV質(zhì)粒 pAAV-ZsGreen-ShRNA RNAi AAV載體，帶GFP標(biāo)記 pAAV-tdTomato-ShRNA RNAi AAV載體，帶RFP標(biāo)記 pAAV-IRES-hrGFP 過(guò)表達(dá)AAV載體，帶GFP標(biāo)記 pAAV-IRES-ZsGreen 過(guò)表達(dá)AAV載體，帶GFP標(biāo)記 pAAV-IRES-tdTomato 過(guò)表達(dá)AAV載體，帶RFP標(biāo)記 pAAV-hRK1-IRES-ZsGreen 過(guò)表達(dá)AAV載體，帶GFP標(biāo)記，帶RK1啟動(dòng)子 pHelper AAV系統(tǒng)質(zhì)粒 pAAV2/1 AAV系統(tǒng)質(zhì)粒，血清型1型 pAAV2/2 AAV系統(tǒng)質(zhì)粒，血清型2型 pAAV2/3 AAV系統(tǒng)質(zhì)粒，血清型3型 pAAV2/4 AAV系統(tǒng)質(zhì)粒，血清型4型 pAAV2/5 AAV系統(tǒng)質(zhì)粒，血清型5型 pAAV2/6 AAV系統(tǒng)質(zhì)粒，血清型6型 pAAV2/7 AAV系統(tǒng)質(zhì)粒，血清型7型 pAAV2/8 AAV系統(tǒng)質(zhì)粒，血清型8型 pAAV2/9 AAV系統(tǒng)質(zhì)粒，血清型9型 pDC316-mCMV-EGFP 過(guò)表達(dá)腺病毒載體，帶GFP標(biāo)記 pDC316-mCMV-ZsGreen 過(guò)表達(dá)腺病毒載體，帶GFP標(biāo)記 pDC316-mCMV-tdTomato 過(guò)表達(dá)腺病毒載體，帶RFP標(biāo)記 pDC316-EGFP-ShRNA RNAi 腺病毒載體，帶GFP標(biāo)記 pDC316-ZsGreen-ShRNA RNAi 腺病毒載體，帶GFP標(biāo)記 pBHG(△E1，E3) Ad5型腺病毒系統(tǒng)質(zhì)粒 pBGN-ShRNA1 RNAi腺病毒表達(dá)載體，帶GFP標(biāo)記 pBGN-ShRNA2 RNAi腺病毒表達(dá)載體，帶GFP標(biāo)記 pBGN-ShRNA3 RNAi腺病毒表達(dá)載體，帶GFP標(biāo)記 pBGN-ShRNA4 RNAi腺病毒表達(dá)載體，帶GFP標(biāo)記 pBGN-ShRNA RNAi表達(dá)載體，帶GFP標(biāo)記 pBGN-MiRNA microRNA表達(dá)載體，帶GFP標(biāo)記 pBRN-ShRNA RNAi表達(dá)載體，帶RFP標(biāo)記 pBIGN-ShRNA RNAi表達(dá)載體及過(guò)表達(dá)載體，帶GFP標(biāo)記
另外，BioVector NTCC質(zhì)粒載體菌種細(xì)胞基因保藏中心提供腺病毒系統(tǒng)（
AAV應(yīng)用介紹
A. AAV9感染小鼠腦組織（PMID: 23503602）
B. AAV2感染大鼠腦組織
C. AAV2感染腎臟（PMID: 23216315）
D. AAV感染心臟（PMID: 20703310）
E. AAV9感染骨骼肌（PMID: 21811247）
F. AAV感染肝臟（PMID: 19861950）
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