(一)什么是雙熒光素酶？

答：雙熒光素酶通常是指螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素。其中熒火蟲熒光素是從甲蟲（Photinus pyralis）中分離得到，分子量為61kDa；而海腎（Renilla）熒光素酶則是從海腎（Renilla reniformis）中分離，分子量為36kDa。這兩種酶的區別之一是他們的底物和輔因子不同：螢火蟲熒光素酶需要熒光素、氧氣、ATP和鎂離子同時存在才能發光；而海腎熒光素酶僅需要腔腸素（coelenterazine）和氧氣。螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的區別之二是發光的顏色不同：螢火蟲熒光素酶產生的光顏色呈現黃綠色，波長550-570nm；而海腎熒光素酶產生藍光，波長480nm。正是由于這兩種酶的底物和發光顏色不同，所以在雙報告實驗中得到廣泛應用，它們的發光原理如下所示：

(二)為什么要采用雙熒光素酶報告系統？

答：單報告基因實驗往往會受到各種實驗條件的影響，而雙報告基因則通過共轉染的“對照”作為內參為試驗提供一基準線，從而可以在最大程度上減小細胞活性和轉染效率等外在因素對實驗的影響，使得數據結果更為可信。

(三)雙熒光素酶在miRNA驗證其靶基因方面的原理是什么？

答：雙螢光素酶報告基因檢測系統在細胞中同時表達螢火蟲螢光素酶和海腎螢光素酶，兩者沒有種源同源性并對應不同的反應底物，故而沒有交叉干擾。得益于超強的光信號和超高的信噪比，本系統被廣泛用于 miRNA靶基因驗證。 miRNA 主要通過作用于靶基因的 3’UTR 起作用，可以將目的基因 3’UTR 區域構建至載體中報告基因 luciferase 的后面，通過比較過表達或者干擾 miRNA 后，報告基因表達的改變（監測螢光素酶的活性變化）可以定量反映 miRNA 對目的基因的抑制作用，也即用熒光值來判斷miRNA是否和靶基因結合。

(四)在利用雙熒光素酶驗證miRNA的靶基因方面，插入的3’UTR長度應該是多少？

答：靶基因的3’UTR長度不一，將全長都插入載體中不切實際，通常只插入包括miRNA結合位點前后200bp左右的序列，大概就是400bp[1]，但也有文獻插入的是80個bp[2]，有文獻選擇了200多個bp[3]，但嚴格來講，應該選擇400bp，以結合位點為中心，上游200bp，下游200bp。

(五)常用的雙熒光素酶載體有哪些？

答：常用的載體有兩種策略。第一種是兩種熒光素分別位于兩個載體上，第二種是兩種熒光素酶位于同一個載體上。以第一種為例，這兩種載體分別為pMIR-REPORT miRNA載體和pRL-TK載體。經檢索發現，pMIR-REPORT miRNA載體是由Ambion開發的載體，它用來克隆插入miRNA靶序列，評估細胞內miRNA功能的載體，該載體的圖譜如下所示：

另外的一個載體是pRL-TK載體，這個載體是由Promega開發的，pRL-TK是海腎熒光素酶報告載體，含有SV40增強子，質粒圖譜如下所示：

從這兩個圖譜中可以發現，pMIR-REPORT miRNA這個載體主要是用于評估miRNA與靶基因3’UTR的結合，靶基因的3’UTR放在熒光素酶的后面，這個熒光素酶是熒火蟲熒光素酶，而pRL-TK這個載體則表達海腎熒光素酶，將這兩個質粒共同轉染進入293細胞中來檢測熒光時，pRL-TK這個質粒起到一個內參的作用。

第二種方案就是將熒火蟲熒光素酶與海腎熒光素酶構建到一個載體上，這樣偏差更小，畢竟轉染一個質粒比轉染兩個質粒要容易，在這方面，根據檢索到的資料顯示，

pLuc2-MCS-RLuc-neo用于microRNA靶基因驗證的雙熒光素酶載體，帶有RLuc和Luc雙熒光。該載體由Biovector保藏中心提供，圖譜如下所示：

phRluc-miR-Luc用于microRNA靶基因驗證的雙熒光素酶載體 ，有BioVector保藏中心提供：

pmiRTarget-Luc-RLuc雙熒光素酶miRNA靶基因驗證載體，miR靶標3‘UTR插入在hLuc的c端MCS區。圖譜如下所示：

(六)在檢測miRNA靶基因時，需要設置多少個分組？

答：首先要知道，插入的靶基因原始3’UTR的質粒叫野生型質粒，除此之外，還需要在螢火蟲熒光素酶3’UTR插入miRNA結合位點突變的序列載體，這個質粒通常叫突變型質粒，最后還有各種對照載體，包括螢火蟲熒光素酶空載體，miRNA空載體，還有海腎素熒光載體，以文獻中的案例 [4]說明，此文獻使用了6組來進行驗證，其分組以及分組說明如下所示：

注：pGL3是熒光素酶報告質粒，綠色的是對照組，即不加miRNA質粒，紅色的是正常組，加miRNA質粒。思路即為熒光素酶質粒（3種情況：①空質粒；②加了WT靶基因3’UTR的質粒；③加了MUT的靶基因3’UTR的質粒）×miRNA precursor（兩種情況，即加與不加），經排列組合，即為6組，詳細說明如下所示：

理想結果：第四組降低，即miRNA能夠與靶基因的3UTR結合，第六組不變，即突變后靶基因3‘UTR不與miRNA結合。

(七)在檢測熒光方面，所使用的儀器是哪些？

答：最經典的儀器就是Promega的GloMax 20/20 發光檢測儀。但也可以用全波長酶標儀來檢測（本實驗室的儀器是VARIOSKAN LUX）。螢火蟲熒光素酶產生的光顏色呈現黃綠色，波長550-570nm；而海腎熒光素酶產生藍光，波長480nm。

(八)測得結果的數據如何處理？

答：測得的結果一個螢火蟲熒光素酶產生的光信號，記為RL1，，海腎熒光素酶產生的信號，記為RL2。RL1/RL2將數據均一化后，每兩組之間用ANOVA檢測即可。

(九)參考資料

1. Nicolas, F.E., Experimental Validation of MicroRNA Targets Using a Luciferase Reporter System, in MicroRNAs in Development: Methods and Protocols, T. Dalmay, Editor. 2011, Humana Press: Totowa, NJ. p. 139-152.

2. Zhu, J., et al., TNF-alpha mRNA is negatively regulated by microRNA-181a-5p in maturation of dendritic cells induced by high mobility group box-1 protein. Sci Rep, 2017. 7(1): p. 12239.

3. Zhu, S., et al., MicroRNA-21 targets the tumor suppressor gene tropomyosin 1 (TPM1). J Biol Chem, 2007. 282(19): p. 14328-36.

4. Shimono, Y., et al., Downregulation of miRNA-200c links breast cancer stem cells with normal stem cells. Cell, 2009. 138(3): p. 592-603.