枯草芽孢桿菌食品級表達(dá)質(zhì)粒pXFGT03和pXFGT05載體

以基因dal作為選擇標(biāo)記,以新型Theta型復(fù)制子作為食品級表達(dá)載體的骨架,以啟動(dòng)子P43作為外源基因表達(dá)用啟動(dòng)子,構(gòu)建了食品級表達(dá)質(zhì)粒pXFGT03和pXFGT05,其中pXFGT05是pXFGT03刪除了復(fù)制子中兩個(gè)開放閱讀框ORF-3和ORF-4后的衍生物,研究結(jié)果表明刪除該兩個(gè)開放閱讀框?qū)τ谫|(zhì)粒的復(fù)制功能沒有明顯影響。 將BgaB的編碼基因bgaB分別克隆到質(zhì)粒pXFGT03和pXFGT05中得到質(zhì)粒pXFGT03-bgaB和pXFGT05-bgaB,此二質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到宿主菌株FG01中得到食品級重組表達(dá)菌株FG01 (pXFGT03-bgaB)和FG01 (pXFGT05-bgaB)。對此二菌株的搖瓶發(fā)酵和酶活測定表明,它們表達(dá)的BgaB酶活量大致相當(dāng),在13 h時(shí),酶活分別達(dá)到1.90 U/(mg protein)和2.01 U/(mg protein),是整合表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的BgaB酶活最大值的10倍以上。對此二質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)和分離穩(wěn)定性的研究表明,在沒有選擇壓力的情況下傳100代后,其穩(wěn)定性均為100%。 將基因bgaB與枯草芽孢桿菌中性蛋白酶NprB的信號肽編碼序列拼接并構(gòu)建了分泌表達(dá)質(zhì)粒pMKSigbgaB01,該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到168株后進(jìn)行了BgaB的表達(dá)研究,結(jié)果表明該信號肽不能夠有效引導(dǎo)BgaB的分泌。將基因bgaB與磷酸二酯酶PhoD的信號肽編碼序列拼接并構(gòu)建了分泌表達(dá)質(zhì)粒pMKSigbgaB03,該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入168株后可以在低磷酸鹽培養(yǎng)基中利用Tat分泌途徑分泌BgaB。將該信號肽和目標(biāo)基因的融合片段克隆到啟動(dòng)子PHpaII控制之下得到分泌表達(dá)質(zhì)粒pMASigbgaB05。該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入168株后,可在豐富培養(yǎng)基中分泌表達(dá)BgaB,在重組菌株發(fā)酵培養(yǎng)的8-18 h中,上清液中的BgaB酶活占總酶活的比例最高接近40%,平均值為27.5%。 將大腸桿菌Sec分泌途徑分子馬達(dá)蛋白質(zhì)SecA的編碼基因secA和細(xì)胞內(nèi)分子伴侶SecB的編碼基因secB整合到枯草芽孢桿菌染色體后,在0.5%木糖存在條件下誘導(dǎo)SecA和SecB的表達(dá),結(jié)果表明這兩個(gè)Sec途徑蛋白質(zhì)的引入和表達(dá)不能夠有效促進(jìn)報(bào)告蛋白質(zhì)青霉素G?；冈诳莶菅挎邨U菌中的分泌。

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