枯草芽孢桿菌分泌表達質粒pMKSigbgaB05載體

以基因dal作為選擇標記,以新型Theta型復制子作為食品級表達載體的骨架,以啟動子P43作為外源基因表達用啟動子,構建了食品級表達質粒pXFGT03和pXFGT05,其中pXFGT05是pXFGT03刪除了復制子中兩個開放閱讀框ORF-3和ORF-4后的衍生物,研究結果表明刪除該兩個開放閱讀框對于質粒的復制功能沒有明顯影響。 將BgaB的編碼基因bgaB分別克隆到質粒pXFGT03和pXFGT05中得到質粒pXFGT03-bgaB和pXFGT05-bgaB,此二質粒轉化到宿主菌株FG01中得到食品級重組表達菌株FG01 (pXFGT03-bgaB)和FG01 (pXFGT05-bgaB)。對此二菌株的搖瓶發酵和酶活測定表明,它們表達的BgaB酶活量大致相當,在13 h時,酶活分別達到1.90 U/(mg protein)和2.01 U/(mg protein),是整合表達系統表達的BgaB酶活最大值的10倍以上。對此二質粒的結構和分離穩定性的研究表明,在沒有選擇壓力的情況下傳100代后,其穩定性均為100%。 將基因bgaB與枯草芽孢桿菌中性蛋白酶NprB的信號肽編碼序列拼接并構建了分泌表達質粒pMKSigbgaB01,該質粒轉化到168株后進行了BgaB的表達研究,結果表明該信號肽不能夠有效引導BgaB的分泌。將基因bgaB與磷酸二酯酶PhoD的信號肽編碼序列拼接并構建了分泌表達質粒pMKSigbgaB03,該質粒轉入168株后可以在低磷酸鹽培養基中利用Tat分泌途徑分泌BgaB。將該信號肽和目標基因的融合片段克隆到啟動子PHpaII控制之下得到分泌表達質粒pMASigbgaB05。該質粒轉化入168株后,可在豐富培養基中分泌表達BgaB,在重組菌株發酵培養的8-18 h中,上清液中的BgaB酶活占總酶活的比例最高接近40%,平均值為27.5%。 將大腸桿菌Sec分泌途徑分子馬達蛋白質SecA的編碼基因secA和細胞內分子伴侶SecB的編碼基因secB整合到枯草芽孢桿菌染色體后,在0.5%木糖存在條件下誘導SecA和SecB的表達,結果表明這兩個Sec途徑蛋白質的引入和表達不能夠有效促進報告蛋白質青霉素G?；冈诳莶菅挎邨U菌中的分泌。

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