BioVector NTCC質粒載體菌株細胞蛋白抗體基因保藏中心提供雙熒光素酶系統相關質粒

簡介：

雙熒光素酶報告基因檢測是通常以螢火蟲熒光素(Firefly luciferin，簡稱Fluc)為報告基因，以海腎熒光素酶(Renilla luciferase，簡稱Rluc)作為內參基因。Fluc以熒光素(luciferin)為底物，在Mg²⁺、ATP和O₂存在下，可以催化luciferin氧化成oxyluciferin而發出生物熒光(bioluminescence)。在Fluc表達框的上游啟動子區域插不同功能序列，可通過轉錄起始條件造成其熒光的變化；在Fluc的3’UTR區域插入待驗證的靶序列，通過其翻譯抑制或mRNA穩定性降低，可以反映是否存在靶向互作。Rluc以腔腸素(coelenterazine)為底物，在O₂存在下催化coelenterazine氧化生成coelenteramide的過程發出生物熒光；通常由固定組成型啟動子驅動，在報告系統中作為校正的內參信號。

雙螢光素酶的應用方向
1、驗證microRNA同mRNA靶向互作：將待測基因序列插入報告基因載體的3’UTR，再共轉入microRNA，檢測熒光素酶活性下降，則提示為其靶序列。
2、驗證microRNA同lncRNA靶向互作：將待測lncRNA序列插入報告基因載體的3’UTR區域，檢測熒光素酶活性。
3、啟動子結構分析：將啟動子區域(約2k左右)進行分段截短或突變，構建入報告基因載體，檢測熒光素酶活性。
4、驗證信號通路是否激活：將該信號通路的下游相應原件序列構建入報告基因載體，檢測不同上游條件下，其熒光素酶活性，即下游信號通路的響應情況。
5、驗證轉錄因子同其調控序列：將該序列(通常為啟動子序列)插入在報告基因載體中，同時在該實驗細胞中共轉轉錄因子，分析該轉錄因子過表達是否提高熒光素酶活性。
雙螢光素酶實驗的具體步驟
1、報告基因質粒的構建：將目的片段插入到熒光素酶表達的報告基因載體上；
2、轉染細胞：將報告基因質粒和轉錄因子質粒共轉染細胞；
當兩種熒光素酶分別在兩個載體上共轉染時，由于內參具有很強的啟動子，因此報告基因質粒:內參轉染量一般為10:1~50:1。
3、提取蛋白，用于熒光素酶檢測；
4、加入底物，Luciferase活性測定：
⑴ 初次使用時，配制熒光素酶測試試劑LAR II，即Firefly luciferase的底物。將LAR II溶解在LAR II buffer中，并分裝-80℃避光保存。
⑵ 加入1X PLB裂解液，室溫裂解細胞15 min。
⑶ 配制Stop&Glo，即Renilla luciferase的底物，能夠終止LAR II的反應。
⑷ 測定熒光值：向40 ul的LAR II中加入10 ul細胞裂解液，吹打混勻后，檢測讀數，即為Firefly luciferase的值。加入40 ul Stop&Glo，再次讀數，即為Renilla luciferase的值。
⑸ 數據處理：首先計算出每管的Firefly luciferase/Renillaluciferase的比值，再以control組的比值為單位1，即可得到不同處理組的相對luciferase活性，也就是該處理組基因轉錄的調控活性。

雙熒光素酶報告基因檢測常用的載體有兩種策略：
一、兩種熒光素酶位于同一個載體上
哺乳細胞
pmirGLO（microRNA與mRNA，lncRNA靶向互作）
SV40啟動子驅動hRluc的表達作為內參，PGK啟動子驅動Luc作為報告基因，將待驗證的元件克隆至Luc的3’端。
psiCHECK-2（microRNA與mRNA，lncRNA靶向互作）
HSVTK啟動子驅動Luc作為內參，SV40啟動子驅動hRluc作為報告基因，將待驗證的元件克隆至hRluc的3’端。

植物
pGreen II-0800-Luc（啟動子檢測）
35S啟動子驅動hRluc的表達作為內參，Luc作為報告基因，將待驗證的啟動子序列克隆至Luc的5’端，檢測啟動子的活性。
pGreenII-0800-miRNA（microRNA與mRNA，lncRNA靶向互作）
35S啟動子驅動hRluc的表達作為內參，35S啟動子驅動Luc作為報告基因，將待驗證的元件克隆至Luc的3’端。
二、兩種熒光素分別位于兩個載體上：
內參載體pRL系列：可在哺乳細胞中組成型表達海洋腔腸熒光素酶Rluc，提供不同的啟動子構型，可與螢火蟲熒光素酶載體組合，作為報告基因的內參。在Rluc上游是一個T7啟動子，可在體外合成Rluc的轉錄物。
pGL4.74
pRL-CMV
CMV啟動子在多種細胞中可高強度、組成型地表達。
pRL-SV40
SV40啟動子在多種細胞中可高強度、組成型地表達。
pRL-TK
HSV-TK啟動子在胚胎和成熟的哺乳細胞中，可低水平、組成型地表達。
報告基因載體：將待驗證的序列或元件插入到報告基因載體中，根據熒光素酶的活性反映檢測的結果。
Luc2基因經過改造，去除大部分隱藏的轉錄因子結合位點，并通過編碼優化提高了在哺乳細胞中的表達效率。Luc2P基因和Luc2CP基因在Luc基因的基礎上增加了降解序列，可以調控Luc2基因在細胞中的半衰期，從而使基因對刺激的響應更快，但會影響其信號強度。Luc2基因半衰期為3小時，Luc2P基因半衰期為1小時，Luc2CP基因半衰期為0.4小時；其信號強度相反。
1、驗證miRNA與靶基因3’UTR的結合：將靶基因3’UTR序列插入到熒光素酶的后面。
pMIR-Report Luciferase（CMV啟動子）
pGL6-miR（PGK啟動子）
2、驗證miRNA同lncRNA靶向互作：將待測lncRNA序列插入到熒光素酶的前面。
pMIR-Report Luciferase（CMV啟動子）
pGL6-miR（PGK啟動子）
3、分析啟動子/增強子：將啟動子區域分段或突變，插入到熒光素酶前面。
pGL4.11[luc2P]
pGL4.14[luc2/Hygro]
pGL6
pGL3-Basic，不含啟動子及增強子，將可能的啟動子序列克隆到熒光素酶基因的上游，可測定其是否具有啟動熒光素酶基因表達的活性。
pGL3-Promoter 含SV40的啟動子可驅動熒光素酶基因表達。插入可能的增強子可增加熒光素酶基因的表達。
pGL3-Enhancer，在熒光素酶基因下游插入了SV40增強子，這可用于測定能增強熒光素酶基因表達的啟動子。
pGL3-Control：含SV40的啟動子及增強子，能產生高水平的熒光素酶基因表達。可作為檢測轉染頻率的陽性對照。
4、驗證轉錄因子同其調控序列：將調控序列（通常為啟動子、增強子等調控元件）插入到熒光素酶前面，研究調控序列的基因轉錄調控活性。
pGL4.26[luc2-minP-Hygro]：
pGL4.27[luc2P minP Hygro]：
5、信號通路研究
Wnt信號通路
TopFlash：（Mini-TK promoter）
TopFlash用于檢測Wnt信號通路中β-catenin介導的TCF/LEF轉錄活性水平，在熒光素上游有兩組TCF/LEF結合位點序列，每組有三個重復序列，一組為正向序列，另一組是它的反向互補序列，可以高靈敏度地檢測TCF/LEF的轉錄活性水平。TCF/LEF的轉錄活性水平與熒光素酶活性成正比，測定Wnt信號通路的激活水平。
FopFlash：（Mini-TK promoter）
FOPFlash質粒：在熒光素酶前面插入突變的TCF/LEF結合位點序列，是TOPFlash的陰性對照報告基因質粒。
pGL4.49[luc2P/TCF-LEF RE/Hygro]：
P53信號通路
pP53-TA-Luc：（TA promoter）
用于檢測P53信號通路中P53轉錄活性水平，在熒光素上游插入P53結合位點序列。
JAK-STAT信號通路
pStat3-TA-Luc：TA promoter）
用于檢測JAK-STAT信號通路中STAT3轉錄活性水平，在熒光素上游插入4個STAT3結合位點序列。
pGL4.52[Luc2P STAT5 RE Hygro]：
pGL4.47[luc2P SIE Hygro]：
SIE：sis-inducible element
pISRE-TA-luc：（TA promoter）
檢測ISRE轉錄活性水平，在熒光素上游插入9個ISRE結合位點序列（GAAACT）。監測 Jak/STAT 介導的信號轉導通路中STAT1和STAT2異二聚體的轉錄，STAT1和STAT2異二聚體與順式作用的 ISRE 增強子元件結合后，轉錄被誘導，報告基因被激活。
TGF-β/BMP信號通路
pAP1-Luc：（TA promoter）
用于檢測TGF-β信號通路中AP1轉錄活性水平，在熒光素上游插入6個AP1結合位點序列。
pGL4.48[luc2P SBE Hygro]
SBE：Samd-binding element
cAMP-PKA信號通路
pGL4.29-Luc2P-CRE-Hygro-CMV-EGFP
CRE：cyclic AMP response element，cAMP反應元件，參與多條信號通路；含有3個重復的CRE結合位點序列。
NFκB信號
pNFκB-TA-luc ：用于檢測NFκB信號通路中NFκB轉錄活性水平，在熒光素上游插入2個NFκB結合位點序列(GGGAA TTTCCGGGAA TTTCC)。
其他轉錄因子
pNFAT-TA-Luc（TA promoter）
用于檢測NFAT信號通路中NFAT轉錄活性水平，在熒光素上游插入NFAT結合位點序列。
pE2F-TA-Luc（TA promoter）
監測 E2F 介導的信號轉導途徑，E2F是成視網膜細胞瘤基因 (Rb) 的主要靶點，E2F蛋白與DP1蛋白形成異二聚體復合物 E2F/DP1，與順式作用的 E2F 增強子元件結合后，轉錄被誘導，報告基因被激活。
pGRE-Luc（TA promoter）
檢測GRE糖皮質激素介導的信號通路激活水平，在熒光素上游插入GRE結合位點序列。
pGL4.42[luc2P HRE Hygro]
HRE：hypoxia response element 低氧反應元件，調節相關基因的轉錄表達，使細胞避免或適應低氧狀態；含有4個重復的HRE結合位點序列。
pARE-luc：檢測ARE(antioxidant response element，抗氧化響應元件)的轉錄活性水平，在熒光素上游插入了2個ARE結合位點（ACTGAGGGT GACTCAGCAAAATC），可以用于檢測細胞的抗氧化水平或氧化應激狀態。

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