慢病毒包裝二質粒系統使用方法-中文

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一、慢病毒包裝
      基本介紹：慢病毒包裝系統由一個包裝質粒混合物和慢病毒載體質粒組成，慢病毒質粒pLVX-Puro包含HIV的基本元件5’ LTR和3’ LTR以及一些輔助元件；pSPAX2質粒含編碼HIV病毒主要蛋白的gag基因和編碼病毒特異性酶的pol基因；pMD2.G質粒含有提供病毒包裝需要的VSV-G基因。
      實驗材料：指數生長的293T細胞；轉染試劑；病毒包裝質粒Mix= pLVX: pSPAX2: pMD2.G=4:3:1（以上5種生物材料我們平臺均可提供）
      包裝步驟：
1、細胞分盤：通過胰酶消化收集細胞，接種于培養皿（根據您實驗需要選擇）。置于含5% CO₂的37℃培養箱孵育8-24h，細胞貼壁后進行轉染。
2、混勻核心質粒和包裝質粒:取無菌1.5ml EP管，加入400μl 無血清DMEM，加入1.5μg 核心質粒和1.5μg 病毒包裝質粒，及6μl lipo2000，充分混勻，靜置15-20min。
3、孵育：將這400μl的混合液逐滴加入細胞培養皿中，輕輕混勻后置于含5％CO₂的37℃培養箱孵育。
4、收集病毒上清：轉染后24h、48h左右收集含慢病毒的上清，分裝凍存于-80℃。
5、病毒感染：將細胞平鋪于35mm培養皿，12-24h后換液，最佳密度為30%－50％。加入收集的病毒上清液培養。細胞長滿后傳代或者檢測表達。

二、包裝檢測
1、含有熒光標記或報告基因的病毒載體，可通過轉染細胞測定其滴度。
2、不含報告基因的病毒載體，可通過試劑盒測定病毒顆粒中相關病毒蛋白的活性或含量確定其滴度。
3、通過定量PCR測定滴度。

三、注意事項
1、避免小提的質粒，其濃度和純度一般比大提質粒的濃度低，可能會降低包裝效率。
2、轉染時的細胞密度在40-60%之間比較合適，當細胞出現匯合時，及時更換或添加新鮮培養基以保持細胞健康狀態。
3、收集病毒上清時離心可以去除細胞碎片及少數懸浮的293T細胞，必要時可以過濾以徹底去除細胞成分的污染。
4、收集病毒時，過濾會去除細胞污染，VSV-G殘留片段對細胞的毒性，但也會部分影響病毒滴度。
5、避免多次反復凍融，凍融會降低病毒侵染效率；病毒放置于4℃也會降低侵染效率。
6、VSV-G會介導病毒與細胞的融合，對細胞造成一定毒性，所以在重懸病毒沉淀時，體積視具體實驗而定。
7、使用病毒侵染細胞時，細胞密度對侵染效率影響較大，細胞匯合密度過高會降低侵染效率。

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