pTrc-DzCMK plasmid vector原核表達質(zhì)粒載體

薯蕷皂苷元(又稱皂素)是合成眾多甾體類藥物的重要中間體。盾葉薯蕷的根狀莖富含皂素,是我國皂素生產(chǎn)的主要原料。迄今為止,皂素的生物合成途徑還沒有被完全闡明,人們普遍認為細胞質(zhì)甲羥戊酸(MVA)途徑所形成的異戊二烯焦磷酸(IPP)及其異構(gòu)體二甲基丙烯基焦磷酸(DMAPP)是皂素合成的重要前體物質(zhì)。眾所周知,在高等植物的質(zhì)體中也存在著一條合成IPP和DMAPP的2-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸(MEP)途徑。有報道表明,在一些植物中MEP和MVA途徑所合成的IPP和DMAPP存在交流,但在盾葉薯蕷中這種交流是否存在、MEP途徑是否參與皂素生物合成等問題尚未見報道。為了今后探討這些問題,本研究利用RT-PCR和RACE等技術(shù)克隆得到了盾葉薯蕷MEP途徑的4-胞苷5-磷酸-2-C-甲基-D-赤蘚糖醇激酶(CMK,MEP途徑的第四個酶)和4-羥基-3甲基-2赤蘚磷酸合酶(HDS,MEP途徑的第六個酶)的cDNA基因,并驗證了它們功能。主要研究結(jié)果如下:1、盾葉薯蕷CMK的cDNA基因(命名為DzCMK)全長1303 bp,包含一個1170 bp的開放閱讀框,60 bp的5’非翻譯區(qū)(5’untranslational region,5’UTR)和73 bp的3’非翻譯區(qū)(3’untranslational region,3’UTR)。DzCMK編碼一個由389個氨基酸殘基組成的蛋白(DzCMK)。該蛋白的預測分子量為42.99 KD、等電點為6.77;其氨基酸序列與其它植物的CMK的一致性比較高,與巴西橡膠樹CMK的一致性高達82%;具有CMK蛋白三個典型的結(jié)合域,Motif A、Motif B和Motif C,并在N末端有一個有44氨基酸殘基組成的質(zhì)體信號肽。2、盾葉薯蕷HDS的cDNA基因(命名為Dz HDS)全長2488 bp,包含一個2250 bp的開放閱讀框,60 bp的5’UTR和178 bp的3’UTR。DzHDS編碼一個由749個氨基酸殘基組成的蛋白(DzHDS)。該蛋白的理論分子量為82.7 KD、等電點為6.08,在N末端有一個有43氨基酸殘基組成的質(zhì)體信號肽,其氨基酸序列與其它植物HDS也有比較高的一致性,其中與菠蘿的一致性最高(88%)。3、分別構(gòu)建了DzCMK和DzHDS大腸桿菌表達載體pTrc-DzCMK和pTrc-DzHDS,并將它們分別與pAC-BETA質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化大腸桿菌。結(jié)果發(fā)現(xiàn),含pTrc-DzCMK與pAC-BETA雙質(zhì)粒的菌落和含pTrc-DzHDS與pAC-BETA雙質(zhì)粒的菌落的黃色比含pAC-BETA與p Trc雙質(zhì)粒菌落顏色明顯要深,表明DzCMK基因和DzHDS基因在大腸桿菌的表達增強了大腸桿菌β-胡蘿卜素的合成,證明DzCMK和DzHDS是MEP途徑中有功能的基因。4、分別把DzCMK和DzHDS基因信號肽編碼序列(CMKP和HDSP)與綠色熒光蛋白(GFP)基因一起構(gòu)建融合基因,CMKP-GFP和HDSP-GFP,并分別將它們克隆到植物雙元表達載體pCAMBIA2×35S-Tnos中,得到pCAMBIA2×35S-CMKP-GFP-Tnos和pCAMBIA2×35S-HDSP-GFP-Tnos兩個植物表達載體。將這兩個載體分別導入根癌農(nóng)桿菌后,利用農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化煙草,并獲得轉(zhuǎn)基因再生植株。制備轉(zhuǎn)基因煙草葉片原生質(zhì)體,通過激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),CMKP-GFP融合蛋白和HDSP-GFP融合蛋白都定位在葉綠體中,這與DzCMK和DzHDS是質(zhì)體MEP代謝途徑的酶相吻合。

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