R5421 Yeast strain/Competent cells K+/鉀離子缺陷型酵母菌株/感受態(tài)細(xì)胞

BioVector's R5421釀酒酵母菌株為K+/鉀離子缺陷型菌株，在文獻(xiàn)中也稱為CY162，多用于K+/鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的鑒定試驗(yàn)。

產(chǎn)品規(guī)格：

BioVector's R5421 Competent Cells: 100μl/支 保存： -80℃（3個(gè)月）


BioVector's pGADT7 (control vector, 10 ng/μl) 10μl 保存：-80℃（12個(gè)月）

Carrier DNA (10 μg/μl) 100μl 保存：-20℃（12個(gè)月）

PEG/LiAC: 5ml 保存： 4℃（12個(gè)月）


基因型

MATα ura3-52 leu2 trk1Δ his3Δ200 his4-15 trk2Δ1::pCK64




產(chǎn)品說明

BioVector's R5421釀酒酵母菌株為K+/鉀離子缺陷型菌株，在文獻(xiàn)中也稱為BioVector's CY162，MATα型，多用于K+/鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的鑒定試驗(yàn)中，也可用于K+/鉀離子通道或鈉鉀離子泵的鑒定試驗(yàn)。Transformation marker為：ura3，leu2，該菌株可以在含有100mM KCl的培養(yǎng)基中國正常生長，在含有5-10mM KCl的培養(yǎng)基中生長緩慢，當(dāng)培養(yǎng)基中KCl濃度低于0.5mM，BioVector's R5421（CY162）細(xì)胞停止生長。R5421感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)特殊工藝制作，-80℃可保存三個(gè)月，BioVector's pGADT7質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率>103 cfu/μg DNA。





操作方法

1. Carrier DNA 在每次使用前要通過加熱處理使其變性為單鏈狀態(tài)，步驟如下：Carrier DNA 放95℃水浴或金屬浴3 min，快速插入冰中，靜置3 min，再次放95℃水浴或金屬浴3 min，快速插入冰中，靜置3 min以上。

2. 取100 μl冰上融化的R5421感受態(tài)細(xì)胞，依次加入預(yù)冷的目的質(zhì)粒0.5-3 μg，Carrier DNA10 μl，PEG/LiAc 500 μl并吸打幾次混勻，30℃水浴30 min (15 min時(shí)翻轉(zhuǎn)6-8次混勻)。

3. 將管放42℃水浴15 min (7.5 min時(shí)翻轉(zhuǎn)6-8次混勻)。

4. 5000 rpm離心 40 s棄上清，ddH2O 400 μl 重懸，離心 30s棄上清。

5. ddH2O 50 μl重懸，涂板，29℃培養(yǎng)48-96 h。





注意事項(xiàng)



1. 感受態(tài)細(xì)胞最好在冰上融化。

2. 轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)粒可相應(yīng)減少最終用于涂板的菌量。

3. 同時(shí)轉(zhuǎn)化2-3種質(zhì)粒時(shí)可增加質(zhì)粒的用量。

4. BioVector's R5421酵母菌株對(duì)高溫敏感，最適生長溫度為27-30℃；高于31℃，生長速度和轉(zhuǎn)化效率呈指數(shù)下降。

5. 菌落變粉不是污染，是酵母細(xì)胞生長中一個(gè)常見現(xiàn)象。當(dāng)細(xì)胞在平板培養(yǎng)幾天后，平板上的Adenine被酵母消耗完畢，酵母試圖通過自身代謝途徑合成Adenine以供利用，然而，有些菌株的ADE2基因被破壞，Adenine合成途徑受阻；又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常，所以造成中間產(chǎn)物P-ribosylamino imidazole (AIR) 在細(xì)胞中積累而使菌落變?yōu)榉奂t色。

6. 酵母在缺陷培養(yǎng)基中生長速度比YPDA培養(yǎng)基慢，培養(yǎng)基中缺陷成分越多，生長越慢，以轉(zhuǎn)化涂板為例：涂YPDA平板29℃，48 h培養(yǎng)可見直徑1 mm克隆；涂SD單缺平板29℃，48-60 h培養(yǎng)可見直徑1 mm克隆，涂SD雙缺平板29℃，60-80 h培養(yǎng)可見直徑1 mm克隆，涂SD三缺或四缺平板平板29℃，80-90h培養(yǎng)可見直徑1 mm克隆。

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