NgAgo-pcDNA3.1-Flag-HA plasmid

描述：

NgAgo-pcDNA3.1-Flag-HA真核表達質(zhì)粒NgAgo基因編輯系統(tǒng)，帶有Flag和HA標簽，CMV啟動子，Amp抗性，Neomycin-G418真核篩選標記。

Map：

替代Cas9的新型基因編輯技術(shù)，Nature最新報道，表達Natronobacterium gregoryi Argonaute，規(guī)避了CAS9天然的弱點-脫靶效應(yīng)，利用短鏈DNA作向?qū)В嬲龑崿F(xiàn)了對基因組的任意位置進行切割，將基因編輯的可能性推入了更廣泛的境地。

該研究成果找到了對基因組位點編輯范圍更廣的基因編輯工具。該工具完全不同于以RNA為向?qū)У腃RISPR/Cas9基因編輯技術(shù)：這種從古細菌來源的Argonaute（簡稱NgAgo），利用短鏈DNA作向?qū)В嬲龑崿F(xiàn)了對基因組的任意位置進行切割，將基因編輯的可能性推入了更廣泛的境地。該項技術(shù)具有以下明確優(yōu)勢：
1. 向?qū)гO(shè)計制作簡便：可以像合成PCR引物一樣合成短鏈單鏈DNA向?qū)В幌驅(qū)Э芍苯愚D(zhuǎn)染細胞和組織而無需構(gòu)建向?qū)П磉_載體。2. 可編輯基因組內(nèi)任何位置：Cas9基因組的靶點選擇受到PAM區(qū)和富含GC區(qū)的限制。而NgAgo對靶點選擇沒有限制，對基因組任何位置都能有效引入雙鏈斷裂。3，由于向?qū)Ш怂崾荄NA而非RNA，因此避免了RNA易于形成復(fù)雜的二級結(jié)構(gòu)而帶來的失效或者脫靶效應(yīng)。4，對游離于細胞核的DNA具有更高的切割效率。
與Cas9技術(shù)相比，Cas9需要19個配對的堿基，并且要求在需要編輯的基因組上這19個堿基后面必須緊鄰一個符合一定特征的三堿基序列（PAM序列），這在一定程度上限制了gRNA的設(shè)計，而NgAgo–gDNA系統(tǒng)不需要PAM序列，拓寬了其設(shè)計范圍。因此，從理論上講，Cas9技術(shù)存在極限。


但是，NgAgo結(jié)合24個堿基的gDNA，這比Cas9的gRNA（19個堿基）要長5個堿基，理論上其精確性要提高1024（4的5次方）倍。DNA編輯相當于在一本書中的某個位置找到一個短單詞將它替換成另一個長單詞，這樣就不容易出現(xiàn)誤替換現(xiàn)象。舉個例子，如果替換一篇文章中的the這樣的簡單單詞，很容易把含有the三個字母的單詞誤替換了，如they，但是如果找一個更長的單詞，如pneumonoultramicroscopy，就不容易出現(xiàn)誤替換現(xiàn)象。


不僅如此，NgAgo–gDNA系統(tǒng)對向?qū)蛄?靶序列錯配容忍度很低。gDNA上任何一個堿基的變換都會降低NgAgo的切割效率，如有三個錯配則使其完全失活。這在另外一個機制上提高了NgAgo使用的精確性，特別是一些富含GC序列的地方，NgAgo系統(tǒng)比Cas9系統(tǒng)效率更高。NgAgo的gDNA需要5’端磷酸化的單鏈DNA （5p-ssDNA），這種形式的DNA在哺乳動物細胞中幾乎不存在，這保證了NgAgo不會被內(nèi)源的DNA序列錯誤帶到不該去的地方。該系統(tǒng)的另外一個優(yōu)點是5p-ssDNA是外源轉(zhuǎn)化進細胞的，其時間和濃度可以非常精確地控制。而Cas9系統(tǒng)的gRNA是內(nèi)源表達的質(zhì)粒,難以精確地控制。
該技術(shù)可用于微生物、植物和動物的精準基因改造，以及乙肝、艾滋病或者一些遺傳性疾病的“基因治療”，在人類血液、器官的編輯和再造等方面具有重要意義，在醫(yī)藥，農(nóng)業(yè)，畜牧等產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域具有重要應(yīng)用價值。

RNA 導(dǎo)向的核酸內(nèi)切酶Cas9使得基因編輯成為了一種廣泛應(yīng)用的技術(shù)。然而，盡管科學家們已嘗試多種方式對Cas9系統(tǒng)進行優(yōu)化以提高它的效率和特異性，但該系統(tǒng)的實用性依然受到了一些因素的限制，包括其對導(dǎo)向-靶向（guide–target）錯配的耐受性以及導(dǎo)向RNA相對容易形成二級結(jié)構(gòu)等。

類似于Cas9，來自Argonaute蛋白家族的內(nèi)切酶也可以利用寡核苷酸作為引導(dǎo)，降解侵入性的基因組。Argonautes在基因表達抑制以及抵御外來核酸方面起著關(guān)鍵的作用。

4月12日，發(fā)表在PNAS上的一項研究中，加州大學伯克利分校的研究人員揭示了一種Argonaute非典型的導(dǎo)向RNA特異性，論文的通訊作者是CRISPR先驅(qū)之一的Jennifer A. Doudna。

5月2日，最新發(fā)表在Nature Biotechnology上的一項研究中，河北科技大學以及浙江大學醫(yī)學院的研究人員報告稱，Natronobacterium gregoryi Argonaute（NgAgo）是一種DNA導(dǎo)向的可用于人類細胞基因編輯的核酸內(nèi)切酶。NgAgo可結(jié)合約24個核苷酸大小的5′磷酸化單鏈導(dǎo)向 DNA（guide DNA ，gDNA），有效形成位點特異的DNA雙鏈缺口。

據(jù)悉，CRISPR/Cas9的靶向特異性 是由兩部分決定的，一部分是RNA嵌合體和靶DNA之間的堿基配對，另一部分是Cas9蛋白和一個短DNA基序（DNA motif）的結(jié)合，這個短DNA基序通常在靶DNA的3'末端發(fā)現(xiàn)，被稱為前間區(qū)序列鄰近基序（protospacer adjacent motif，PAM）[文獻]。

與Cas9不同，NgAgo–gDNA系統(tǒng)不需要PAM，初步鑒定表明，該系統(tǒng)對導(dǎo)向-靶向（guide–target）錯配耐受低，且對編輯富含G+C的基因組更加有效。據(jù)介紹，Cas9只存在于原核生物中，而Argonautes幾乎存在于所有的有機體中。

此外，要想與Cas9正確綁定，導(dǎo)向RNA必須有3′RNA-RNA雜化結(jié)構(gòu)，而與Argonaute綁定不需要導(dǎo)向分子有任何特定的二級結(jié)構(gòu)。另一方面，Cas9只能切割PAM上游的序列，而Argonaute不需要靶標有特定的序列。作者們表示，Natronobacterium gregoryi Argonaute有望成為編輯哺乳動物基因組的精準有效的工具。
該技術(shù)的優(yōu)勢：
　　1. DNA 比RNA更穩(wěn)定，更易操作。操做過RNA的都知道。
　　2. 削減了gRNA并非用于matching的冗余部分，精簡了Primer，取消了PAM的限制，以及5' hairpin stemloop，而且直接用單鏈DNA。這些特質(zhì)都完勝Crispr/Cas9

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