pET-NgAgo原核表達質粒載體

NgAgo基因編輯系統

pET28a-NgAgo

Map：

pET22b-NgAgo,

pET-NgAgo

Map:

描述：

替代Cas9的新型基因編輯技術，Nature最新報道，表達Natronobacterium gregoryi Argonaute，規避了CAS9天然的弱點-脫靶效應，利用短鏈DNA作向導，真正實現了對基因組的任意位置進行切割，將基因編輯的可能性推入了更廣泛的境地。

該研究成果找到了對基因組位點編輯范圍更廣的基因編輯工具。該工具完全不同于以RNA為向導的CRISPR/Cas9基因編輯技術：這種從古細菌來源的Argonaute（簡稱NgAgo），利用短鏈DNA作向導，真正實現了對基因組的任意位置進行切割，將基因編輯的可能性推入了更廣泛的境地。該項技術具有以下明確優勢：
1. 向導設計制作簡便：可以像合成PCR引物一樣合成短鏈單鏈DNA向導；向導可直接轉染細胞和組織而無需構建向導表達載體。2. 可編輯基因組內任何位置：Cas9基因組的靶點選擇受到PAM區和富含GC區的限制。而NgAgo對靶點選擇沒有限制，對基因組任何位置都能有效引入雙鏈斷裂。3，由于向導核酸是DNA而非RNA，因此避免了RNA易于形成復雜的二級結構而帶來的失效或者脫靶效應。4，對游離于細胞核的DNA具有更高的切割效率。
與Cas9技術相比，Cas9需要19個配對的堿基，并且要求在需要編輯的基因組上這19個堿基后面必須緊鄰一個符合一定特征的三堿基序列（PAM序列），這在一定程度上限制了gRNA的設計，而NgAgo–gDNA系統不需要PAM序列，拓寬了其設計范圍。因此，從理論上講，Cas9技術存在極限。


但是，NgAgo結合24個堿基的gDNA，這比Cas9的gRNA（19個堿基）要長5個堿基，理論上其精確性要提高1024（4的5次方）倍。DNA編輯相當于在一本書中的某個位置找到一個短單詞將它替換成另一個長單詞，這樣就不容易出現誤替換現象。舉個例子，如果替換一篇文章中的the這樣的簡單單詞，很容易把含有the三個字母的單詞誤替換了，如they，但是如果找一個更長的單詞，如pneumonoultramicroscopy，就不容易出現誤替換現象。


不僅如此，NgAgo–gDNA系統對向導序列-靶序列錯配容忍度很低。gDNA上任何一個堿基的變換都會降低NgAgo的切割效率，如有三個錯配則使其完全失活。這在另外一個機制上提高了NgAgo使用的精確性，特別是一些富含GC序列的地方，NgAgo系統比Cas9系統效率更高。NgAgo的gDNA需要5’端磷酸化的單鏈DNA （5p-ssDNA），這種形式的DNA在哺乳動物細胞中幾乎不存在，這保證了NgAgo不會被內源的DNA序列錯誤帶到不該去的地方。該系統的另外一個優點是5p-ssDNA是外源轉化進細胞的，其時間和濃度可以非常精確地控制。而Cas9系統的gRNA是內源表達的質粒,難以精確地控制。
該技術可用于微生物、植物和動物的精準基因改造，以及乙肝、艾滋病或者一些遺傳性疾病的“基因治療”，在人類血液、器官的編輯和再造等方面具有重要意義，在醫藥，農業，畜牧等產業領域具有重要應用價值。

RNA 導向的核酸內切酶Cas9使得基因編輯成為了一種廣泛應用的技術。然而，盡管科學家們已嘗試多種方式對Cas9系統進行優化以提高它的效率和特異性，但該系統的實用性依然受到了一些因素的限制，包括其對導向-靶向（guide–target）錯配的耐受性以及導向RNA相對容易形成二級結構等。

類似于Cas9，來自Argonaute蛋白家族的內切酶也可以利用寡核苷酸作為引導，降解侵入性的基因組。Argonautes在基因表達抑制以及抵御外來核酸方面起著關鍵的作用。

4月12日，發表在PNAS上的一項研究中，加州大學伯克利分校的研究人員揭示了一種Argonaute非典型的導向RNA特異性，論文的通訊作者是CRISPR先驅之一的Jennifer A. Doudna。

5月2日，最新發表在Nature Biotechnology上的一項研究中，河北科技大學以及浙江大學醫學院的研究人員報告稱，Natronobacterium gregoryi Argonaute（NgAgo）是一種DNA導向的可用于人類細胞基因編輯的核酸內切酶。NgAgo可結合約24個核苷酸大小的5′磷酸化單鏈導向 DNA（guide DNA ，gDNA），有效形成位點特異的DNA雙鏈缺口。

據悉，CRISPR/Cas9的靶向特異性 是由兩部分決定的，一部分是RNA嵌合體和靶DNA之間的堿基配對，另一部分是Cas9蛋白和一個短DNA基序（DNA motif）的結合，這個短DNA基序通常在靶DNA的3'末端發現，被稱為前間區序列鄰近基序（protospacer adjacent motif，PAM）[文獻]。

與Cas9不同，NgAgo–gDNA系統不需要PAM，初步鑒定表明，該系統對導向-靶向（guide–target）錯配耐受低，且對編輯富含G+C的基因組更加有效。據介紹，Cas9只存在于原核生物中，而Argonautes幾乎存在于所有的有機體中。

此外，要想與Cas9正確綁定，導向RNA必須有3′RNA-RNA雜化結構，而與Argonaute綁定不需要導向分子有任何特定的二級結構。另一方面，Cas9只能切割PAM上游的序列，而Argonaute不需要靶標有特定的序列。作者們表示，Natronobacterium gregoryi Argonaute有望成為編輯哺乳動物基因組的精準有效的工具。
該技術的優勢：
　　1. DNA 比RNA更穩定，更易操作。操做過RNA的都知道。
　　2. 削減了gRNA并非用于matching的冗余部分，精簡了Primer，取消了PAM的限制，以及5' hairpin stemloop，而且直接用單鏈DNA。這些特質都完勝Crispr/Cas9

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