pET28a-6xHis-Biotin-EGFP plasmid

描述：

pET28a-6xHis-Biotin-EGFP生物素標記原核表達載體熒光標簽His標簽。生物素可以與親和素、鏈霉親和素非常緊密地結合，因而，生物素標記蛋白廣泛應用于免疫學、細胞生物學和分子生物學的實驗研究領域，以及作為親和分離制劑，用于相應配基的分離與純化。AviTag是15 個氨基酸的短肽，具有單生物素化賴氨酸位點。

生物素可以與親和素、鏈霉親和素非常緊密地結合，因而，生物素標記蛋白廣泛應用于免疫學、細胞生物學和分子生物學的實驗研究領域，以及作為親和分離制劑，用于相應配基的分離與純化。傳統的生物素標記方法通常利用生物素的羧基加以化學修飾可制成各種活性基團的衍生物，活化生物素可以與各種生物大分子結合，用于標記各種蛋白質(包括抗體、葡萄球菌A蛋白、酶、激素等)、多肽、多糖、核酸及核素、熒光素、膠體金等。由于反應條件比較劇烈，化學方法生物素化過程中，一些相對敏感的蛋白容易失活；同時，由于活化的生物素不具有識別特定蛋白質的能力，因而化學方法生物素化是非特異的。 生物素連接酶 (Biotin Ligase)能活化生物素形成生物素酰 -5'-腺苷酸，將生物素特異地轉移到生物素受體蛋白－AviTag上，使蛋白生物素化。AviTag是15 個氨基酸的短肽，具有一個單生物素化賴氨酸位點，與已知天然可生物素化序列完全不同，可以加在目標蛋白的N端和C端，融合表達后，在體內或體外均可被生物素連接酶生物素化。

與化學生物素標記法相比，生物素AviTag標簽系統具有以下幾大優點： 無論在體外或者體內，幾乎所有的蛋白都可以在一個獨特的AviTag位點輕易且有效地被生物素化； 由于此類生物素化是通過酶和底物的反應來實現，反應條件相當溫和而且標記的專一性極高； 每一個AviTag僅可以加入一個生物素分子，對整個蛋白的活性和功能影響很小。

Biotin ligase催化的生物素化應用實例：

（選取數個基因，表達載體為WG05，同時含有6×His Tag、Sumo與AviTag）

圖二、通過AviTag進行生物素化的重組蛋白示意圖

通過Biotin Ligase生物素化的重組蛋白的檢測：

圖三、通過Biotin Ligase進行生物素化的重組蛋白的表達及檢測

• 考馬斯亮藍染色

• Anti-His Antibody作為一抗進行Western Blotting

• HRP-Streptavidin直接反應檢測生物素化的重組蛋白

• 1．Protein ladder

• 2～11．選取10個基因表達產物（經過Biotin Ligase催化生物素化）

• 12．未經生物素化的基因表達產物

• 13．對照，重組β-葡萄糖苷酸酶（His-Gus）

• 14．對照，參與酶促反應的Biotin Ligase

與抗原抗體反應相比，生物素化的檢測靈敏度更高：

圖四、通過Biotin Ligase生物素化的重組蛋白進行不同方法檢測

• 麗春紅染色

• Western Blotting，DAB顯色
  1,8,9．Protein ladder
  2,10．對照，重組β-葡萄糖苷酸酶（His-Gus）
  3～7,11～15．不同濃度的重組蛋白