GV3101 Chemically Competent Cell 化學感受態細胞

規格：10×100μl

保存條件： -80℃

基因型C58 (rif R) Ti pMP90 (pTiC58DT-DNA) ( gentR/strepR) Nopaline

產品說明

GV3101菌株為C58型背景，核基因中含有篩選標簽——利福平抗性基因rif，為了便于轉化操作，此菌株攜帶一無自身轉運功能的胭脂堿型Ti質粒pMP90 (pTiC58DT-DNA)，此質粒含有vir基因（vir基因是T-DNA插入植物基因組必需的元件，pMP90 (pTiC58DT-DNA)質粒自身的T-DNA轉移功能被破壞，但可以幫助轉入的雙元載體T-DNA順利轉移）。pMP90 (pTiC58DT-DNA)型Ti 質粒含有篩選標簽：Strep和gent，賦予GV3101菌株鏈霉素和慶大霉素抗性，適用于擬南芥、煙草、玉米、土豆等植物的轉基因操作，經pCAMBIA2301質粒檢測轉化效率可達104cfu/μg。

操作方法

1. 取-80℃保存的農桿菌感受態于室溫或手心片刻待其部分融化，處于冰水混合狀態時插入冰中。1. 每100μl感受態加1ug（體積不大于10ul）質粒DNA，用手撥打管底混勻，依次于冰上靜置5分鐘、液氮5分鐘、37℃水浴5分鐘、冰浴5分鐘。3. 加入700μl無抗生素的LB或YEB液體培養基，于28℃振蕩培養2~3小時。4. 6000rpm離心一分鐘收菌，留取100μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊涂布于含相應抗生素的LB或YEB平板上，倒置放于28℃培養箱培養2-3天（當平板只含有50ug/ml kan 時，28℃培養48h即可；平板中同時加入50ug/ml kan，20ug/ml rif 時，需28℃培養60h；如果使用的平板含有50ug/ml rif 則需要28℃培養72-90h）。注意事項1. 感受態細胞最好在冰上融化。2. 混入質粒時應輕柔操作。

備注： 1、農桿菌相關抗生素配方：

抗生素

配方

原液

工作液

羧芐青霉素（carb）

雙蒸水溶解，0.22um濾膜過濾除菌

50mg/ml

50ug/ml

硫酸卡那霉素（kan）

雙蒸水溶解，0.22um濾膜過濾除菌

50mg/ml

50ug/ml

鏈霉素（strep）

雙蒸水溶解，0.22um濾膜過濾除菌

10mg/ml

50ug/ml

利福平（rif）

DMSO溶解，0.22um濾膜過濾除菌

10mg/ml

20ug/ml

慶大霉素（gent）

雙蒸水溶解，0.22um濾膜過濾除菌

20mg/ml

40ug/ml

2、常用農桿菌抗性：（R：抗；S：敏感。）

農桿菌菌株

羧芐青霉素(carb)

鏈霉素(strep)

利福平(rif)

慶大霉素(gent)

硫酸卡那霉素(kan)

AGL-1

R

R

R

S

S

EHA105

S

R

R

S

S

LBA4404

S

R

R

S

S

GV3101

S

R

R

R

S

3、LB及YEB配方：

component

LB(液體)/L

LB(固體)/L

component

YEB(液體)/L

YEB(固體)/L

Tryptone

10g

10g

Tryptone

5g

5g

Yeast extract

5g

5g

Yeast extract

1g

1g

NaCl

10g

10g

牛肉浸膏

5g

5g

NaOH

調PH到7.0

調PH到7.0

蔗糖

5g

5g

Agar

－

15g

MgSO4*7H2O

0.49g

0.49g

NaOH

調PH到7.0

調PH到7.0

Agar

－

15g 注意事項1、加入質粒時體積不應大于感受態體積的1/10 ；質粒不純或存在乙醇等有機物污染，轉化效率急劇下降；質粒增大一倍，轉化效率下降一個數量級。2、混入質粒時應輕柔操作。3、轉化高濃度的質粒可相應減少最終用于涂板的菌量。4、利福平濃度不應高于25ug/ul，過高的利福平濃度不利于農桿菌生長，會降低其生長速度和轉化效率。本公司感受態計算轉化效率時所用平板只含有50ug/ml kan，若所用平板含有20ug/ml rif則轉化效率降低到1/2。5、培養基中加入利福平的目的是防止雜菌生長、篩選農桿菌；根據所用菌株抗性加入鏈霉素或慶大霉素可防止Ti質粒丟失，但鏈霉素不利于農桿菌的轉基因操作，所以一般培養農桿菌時不考慮鏈霉素或慶大霉素，Ti質粒丟失的概率極低（可以忽略）。