Agrobacterium tumefaciens EHA105根癌農(nóng)桿菌菌株及感受態(tài)細(xì)胞

-BioVector NTCC質(zhì)粒載體菌種細(xì)胞蛋白抗體基因保藏中心

Resistance抗性: Rifampicin 20ug/mL Sm:50 ug/mL. Store:4℃

基因型

C58 (rif R) Ti pEHA105 (pTiBo542DT-DNA) (strepR) Succinamopine

產(chǎn)品說明

EHA105 菌株由 EHA105 菌株改造而來，為 C58 型背景，核基因中含有篩選標(biāo)簽——利福平 抗性基因 rif，為了便于轉(zhuǎn)化操作，此菌株攜帶一無自身轉(zhuǎn)運(yùn)功能的琥珀堿型 Ti 質(zhì)粒 pEHA105 (pTiBo542DT-DNA) ，此質(zhì)粒含有 vir 基因（vir 基因是 T-DNA 插入植物基因組必需的元件， pEHA105 (pTiBo542DT-DNA)質(zhì)粒自身的 T-DNA 轉(zhuǎn)移功能被破壞，但可以幫助轉(zhuǎn)入的雙元載 體 T-DNA 順利轉(zhuǎn)移）。pEHA105 (pTiBo542DT-DNA)型 Ti 質(zhì)粒含有篩選標(biāo)簽：strep，賦予 EHA105 菌株鏈霉素抗性，適用于水稻、煙草等植物的轉(zhuǎn)基因操作.

操作方法

1. 取-80℃保存的農(nóng)桿菌感受態(tài)于室溫或手心片刻待其部分融化，處于冰水混合狀態(tài)時(shí)插入冰中。1. 每100μl感受態(tài)加1ug（體積不大于10ul）質(zhì)粒DNA，用手撥打管底混勻，依次于冰上靜置5分鐘、液氮5分鐘、37℃水浴5分鐘、冰浴5分鐘。3. 加入700μl無抗生素的LB或YEB液體培養(yǎng)基，于28℃振蕩培養(yǎng)2~3小時(shí)。4. 6000rpm離心一分鐘收菌，留取100μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊涂布于含相應(yīng)抗生素的LB或YEB平板上，倒置放于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2-3天（當(dāng)平板只含有50ug/ml kan 時(shí)，28℃培養(yǎng)48h即可；平板中同時(shí)加入50ug/ml kan，20ug/ml rif 時(shí)，需28℃培養(yǎng)60h；如果使用的平板含有50ug/ml rif 則需要28℃培養(yǎng)72-90h）。注意事項(xiàng)1. 感受態(tài)細(xì)胞最好在冰上融化。2. 混入質(zhì)粒時(shí)應(yīng)輕柔操作。3. 轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)粒可相應(yīng)減少最終用于涂板的菌量。

備注： 1、農(nóng)桿菌相關(guān)抗生素配方：

抗生素

配方

原液

工作液

羧芐青霉素（carb）

雙蒸水溶解，0.22um濾膜過濾除菌

50mg/ml

50ug/ml

硫酸卡那霉素（kan）

雙蒸水溶解，0.22um濾膜過濾除菌

50mg/ml

50ug/ml

鏈霉素（strep）

雙蒸水溶解，0.22um濾膜過濾除菌

10mg/ml

50ug/ml

利福平（rif）

DMSO溶解，0.22um濾膜過濾除菌

10mg/ml

20ug/ml

慶大霉素（gent）

雙蒸水溶解，0.22um濾膜過濾除菌

20mg/ml

40ug/ml

2、常用農(nóng)桿菌抗性：（R：抗；S：敏感。）

農(nóng)桿菌菌株

羧芐青霉素(carb)

鏈霉素(strep)

利福平(rif)

慶大霉素(gent)

硫酸卡那霉素(kan)

AGL-1

R

R

R

S

S

EHA105

S

R

R

S

S

LBA4404

S

R

R

S

S

GV3101

S

R

R

R

S

3、LB及YEB配方：

component

LB(液體)/L

LB(固體)/L

component

YEB(液體)/L

YEB(固體)/L

Tryptone

10g

10g

Tryptone

5g

5g

Yeast extract

5g

5g

Yeast extract

1g

1g

NaCl

10g

10g

牛肉浸膏

5g

5g

NaOH

調(diào)PH到7.0

調(diào)PH到7.0

蔗糖

5g

5g

Agar

－

15g

MgSO4*7H2O

0.49g

0.49g

NaOH

調(diào)PH到7.0

調(diào)PH到7.0

Agar

－

15g 注意事項(xiàng)1、加入質(zhì)粒時(shí)體積不應(yīng)大于感受態(tài)體積的1/10 ；質(zhì)粒不純或存在乙醇等有機(jī)物污染，轉(zhuǎn)化效率急劇下降；質(zhì)粒增大一倍，轉(zhuǎn)化效率下降一個(gè)數(shù)量級。2、混入質(zhì)粒時(shí)應(yīng)輕柔操作。3、轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)粒可相應(yīng)減少最終用于涂板的菌量。4、利福平濃度不應(yīng)高于25ug/ul，過高的利福平濃度不利于農(nóng)桿菌生長，會降低其生長速度和轉(zhuǎn)化效率。本公司感受態(tài)計(jì)算轉(zhuǎn)化效率時(shí)所用平板只含有50ug/ml kan，若所用平板含有20ug/ml rif則轉(zhuǎn)化效率降低到1/2。5、培養(yǎng)基中加入利福平的目的是防止雜菌生長、篩選農(nóng)桿菌；根據(jù)所用菌株抗性加入鏈霉素或慶大霉素可防止Ti質(zhì)粒丟失，但鏈霉素不利于農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)基因操作，所以一般培養(yǎng)農(nóng)桿菌時(shí)不考慮鏈霉素或慶大霉素，Ti質(zhì)粒丟失的概率極低（可以忽略）。